نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 گروه علوم باغبانی، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه آزاد اسلامی اصفهان (خوراسگان)، اصفهان، ایران. رایانامه: r.khodsiani@khuisf.ac.ir

2 نویسنده مسئول، گروه علوم باغبانی، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه آزاد اسلامی اصفهان (خوراسگان)، اصفهان، ایران. رایانامه: jafarpour@khuisf.ac.ir

10.22059/jci.2023.347719.2741

چکیده

هدف: بتاگلوکان یکی از اجزای دیواره سلولی قارچی و از نظر درمانی مهم‌ترین پلی‌ساکارید در قارچ‌هاست. هدف از این پژوهش تولید ورمی‏کمپوست اختصاصی به‌منظور بهبود ارزش غذایی و برسی محتوای بتاگلوکان در قارچ بلازئی (A. subrufescens) می‌باشد.
روش پژوهش: آزمایشی در قالب طرح کاملاً تصادفی و در سه تکرار در مرکز تحقیقات قارچ دانشگاه آزاد اسلامی اصفهان (خوراسگان) در سال 1400-1399 انجام شد. تعداد 18 بستر ترکیبی به‌عنوان تیمارهای موردبرسی در آزمایش، شامل خاک پوششی 100 درصد به‌عنوان شاهد، کمپوست و ورمی‌کمپوست برگشتی 100 درصد، سرخارگل و ورمی‌کمپوست سرخارگل به‌تنهایی و در ترکیب با خاک پوششی به‌همراه هورمون اکسین (ایندول‌استیک‌اسید) به نسبت‌های معین در نظر گرفته شد.
یافته‌ها: براساس نتایج بسترهای غنی از عناصر معدنی از جمله کمپوست و ورمی‌کمپوست برگشتی قارچ به‌تنهایی و در ترکیب با خاک پوششی منجر به رشد بهینه قارچ بلاز‏ئی شدند. نتایج تجزیه واریانس نشان داد که بیش‌ترین میزان بتاگلوکان با مقدار 86/72 میلی‏گرم بر کیلوگرم و بیش‌ترین سرعت محصول دهی در بسترهایی با منشأ گیاه دارویی سرخارگل مشاهده شد.
نتیجه‌گیری: در مجموع اگر مبنا تولید بیوماس باشد بهتر است از بسترهای کشت غنی‌شده و اگر مبنا تولید ماده مؤثره در قارچ باشد، بهتر است از بسترهایی که با سرخارگل ترکیب شده‌اند، استفاده شود. در پژوهش حاضر ترکیب خاک پوششی50 درصد+ کمپوست و ورمی‌کمپوست برگشتی قارچ 50 درصد در جذب عناصر غذایی و بهبود صفات کمی بهتر نقش ایفا کردند. 

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

The effect of culture media on some morphophysiological characteristics and nutritional value of (Agaricus subrufescens)

نویسندگان [English]

  • Razieh Khodsiyani 1
  • Mehrdad Jafarpour 2

1 Department of Horticulture, Faculty of Agriculture and Natural Resources, Islamic Azad University Isfahan (Khorasgan) Branch, Isfahan, Iran. E-mail: r.khodsiani@khuisf.ac.ir

2 Corresponding Author, Department of Horticulture, Faculty of Agriculture and Natural Resources, Islamic Azad University Isfahan (Khorasgan) Branch, Isfahan, Iran. E-mail: jafarpour@khuisf.ac.ir

چکیده [English]

Objective: Beta-glucan is one of the components of the mushroom cell wall and the most therapeutically important polysaccharide in mushrooms. The aim of this research is to produce a specific vermicompost to improve the nutritional value and evaluate the beta-glucan content in blazai mushroom (A.subrufescens).
Methods: An experiment was conducted in form of a completely randomized design and in three replications at the mushroom research center of Islamic Azad University of Isfahan (Khorasgan) in 1399-1400. It investigated 18 combined substrates as treatments, including casing soil as control, compost and vermicompost, Echinacea vermicompost alone and in combination with casing soil with certain values of the hormone indol acetic acid. Based on the results, richer substrates including compost and vermicompost alone and in combination with casing soil led to the optimal growth of blazai mushrooms.
Results: The results of the analysis of variance showed that the highest amount of beta-glucan with the value of 72.86 mg/kg and the highest ash percentage was observed, namely the substrates with the origin of the Echinacea medicinal plant.
Conclusion: In general, for biomass production, it is better to use richer substrates, yet if the purpose of production of the essential material in the mushrooms, it is better to use substrates that are combined with Echinacea. The present research is the combination of casing soil 50 percent + compost or vermicompost 50 percent in the absorption of nutrients and the improvement of quantitative traits played a slightly better role.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Agricultural waste
  • Biological efficiency
  • Medicinal mushroom
  • Mycelium
  • Polysaccharide
الفتی، جمالعلی و رسولی، فاتح (1395). کاربرد خاک پوششی با ورمی‌کمپوست شسته‌شده بر راندمان بیولوژیکی قارچ صدفی. تحقیقات کشاورزی ایران، 35 (1)،  95-99.
جعفرپور، مهرداد؛ پورسعید، ناصر؛ جلالی‏زند، علیرضا؛ گل‏پرور، احمد رضا و بهداد، مریم (1387). بررسی اثر برخی از ضایعات صنایع تبدیلی کشاورزی و مکمل‏های غذایی بر پاره‌ای خصوصیات رشد قارچ خوراکی صدفی Pleurotus florida. مجله پژوهش در علوم کشاورزی، 4 (2)، 188-203.
چراغی، مهرداد؛ مردوخ‏ روحانی، ندا و لرستانی، بهاره (1391). بررسی میزان غلظت عناصر سنگین در کمپوست، خاک پوششی و قارچ‏های خوراکی دکمه‏ای گلخانه‏های استان کردستان. بهداشت مواد غذایی، 2 ((8)4)، 81-96.
حسینی، سید حسن؛ رفیعی‏الحسینی، محمد و برزگر، رحیم (1396). آثار جایگزینی ورمی‏کمپوست و پرلیت با پیت به‌عنوان خاک پوششی بر رشد و عملکرد قارچ دکمه‏ای (Agaricus bisporus). به‏زراعی کشاورزی، 19(4)، 837-852.
خدابخشی، عباس؛ سدهی، مرتضی و شاکری، کبری (1395). تعیین برخی فلزات سنگین در قارچ­های خوراکی در شهر شهرکرد. مجله دانشگاه علوم پزشکی شهرکرد، 18 (1)، 54-62.
ذکایی، محمود؛ بازیار، سحر و خانه باد، محمد (1389). تکنولوژی پیشرفته تولید خاک پوششی با استفاده از ورمی‌کمپوست برای پرورش قارچ خوراکی (Agaricus bisporus L.). نشریه فیزیولوژی و تکوین جانوری (علوم زیستی). 4 ((12)1)، 19-26.
عبادی، علی؛ علیخانی، حسینعلی؛ یخچالی، باقر و آریانپور، حسام (1394). ارزیابی پسماندهای آلی مختلف برای کشت قارچ دکمه‏ای و تأثیر آن‏ها بر عملکرد و جذب عناصر غذایی. نشریه مدیریت خاک و تولید پایدار، 5 (1)، 243-252.
کاوه، منا؛ پهلوانلو، ابوالفضل و سرابی جماب، محبوبه (1396). قارچ‏ها منابع باارزش بتاگلوکان‏های زیست فعال. مجله ایمنی زیستی، 10 (3)، 65-45.
کیماسی، عباسعلی؛ رمضان، داریوش؛ آران، مهدی و باقری، رضا (1398). بررسی بهینه‏سازی ترکیب‏های مختلف محیط کشت بر برخی از ویژگی‏های کمی و کیفی قارچ صدفی طلایی (Pleurotus citrinopileatus). نشریه پژوهش‏های تولید گیاهی، 26 (2)، 173-193.
لطفی، مجتبی؛ فارسی، محمد؛ میرشمسی‏کاخکی، امین و جانپور، جواد (1397). بررسی تأثیر جدایه­های باکتری Pseudomonas putida بر عملکرد قارچ خوراکی دکمه­ای سفید (Agaricus bisporus). نشریه علوم باغبانی (علوم و صنایع کشاورزی)، 32(2)،  286-273.
ماکنالی، فرشته؛ کاشی، عبدالکریم و حکمتی، جمشید (1393). بررسی اثر بستر کشت و مکمل‏های غذایی روی ارزش غذایی قارچ صدفی فلوریدا. مجله نوآوری در علوم و فناوری غذایی. 6 (1)، 91-98.
مانایی، آزاده؛ وزیران، مهدی و سعید نیا، سودابه (1393). فارماکولوژی، فیتوشیمی و روش‌های تجزیه و تحلیل سرخارگل (Echinacea purpurea). بررسی های فارماکوژنوزی، 9 (17)، 63-72.
مزارعی، فرزاد؛ جوینده، حسین؛ حجتی، محمد و نوشاد، محمد (1395). بهینه سازی استخراج پلی‌ساکاریدهای برگ کبر (Capparis spinose L.) و پتانسیل آنتی‌اکسیدانی، آنتی‌میکروبیالی فعال. نشریه جامع ماکروملکول‌های بیولوژیکی، 95، 224-231.
ملایی، فوزیه و بشارتی، حسین (1390). بررسی تأثیر باکتری‏های محرک رشد گیاه (PGPR) بر خواص کیفی و کمی قارچ دکمه‏ای (Agaricus bisporus) در بسترهای مختلف حاصل از ضایعاتی صنعتی و کشاورزی. فصلنامه پژوهش‏های خاک (علوم خاک و آب)،  25 (4)، 373-384.
ولی­زاده‏کاجی، بابک؛ عباسی­فر، احمد رضا؛ احسنی‏ایروانی، مریم و حسین­آباد، محمد (1398). بررسی تأثیر محلول‌پاشی عصاره ورمی‏کمپوست بر شاخص­های رشد قارچ دکمه­ای (Agaricus bisporus). فن­آوری تولیدات گیاهی (پژوهش کشاورزی)، 19 (1)، 36-29.
 
References
Alam, N., Amin, S. M., & Sarker, N. C. (2007). Efficacy of five different growth regulators on the yield and yield contributing attributes of Pleurotus ostreatus (Jacquin ex Fr.) Kummer. Bangladesh Journal of Mushroom, 1, 51-55.
Beyer, D. M. (2003). Basic procedures for Agaricus mushroom growing. Chester: Pennsylvania State University, College of Agricultural Sciences, Cooperative Extension Publisher.
Bostan, N., Sajid, M., Rabi, F., & Munir, M. (2014). Effects of Growing Media and Irrigation Interval on Flower Production of Amaryllis (Amaryllis Belladonna). Journal of Biology, Agriculture and Healthcare, 4(6), 38-44.
Carneiro, A. A. J., Ferreira, I. C. F. R., Dueñas, M., Barros, L., Da Silva, R., & Gomes, E. (2013). Chemical composition and antioxidant activity of dried powder formulations of Agaricus blazei and Lentinus edodes. Food Chemistry, 138, 2168-2173. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2012.12.036.
Cheraghi, M., Lorestani, B., & Mardokh rohani, N. (2012). Evaluation of heavy metal concentration in compost, soil cover and button mushroom in Kurdistan greenhouses. Food Hygiene, 2(4 (8)), 81-96.) In Persian).
Colauto, N. B., Da Eira, A. F., & Linde, G. A. (2012). Cryopreservation of Agaricus blazei in liquid nitrogen using DMSO as cryoprotectant. Bioscience Journal, 28, 1034-1037.
Ebadi, A., Alikhani, H. A., Yakhchali, M. B., & Aryanfar, H. (2013). Evaluation of different organic wastes for cultivation for bottom mushroom and their effect on yield and nutrient intake. Journal of Soil Management & Sustainable Producation, 5(1), 243-252.) In Persian).
Friedmann Angeli, J. P. V., Ribeiro, L. R., Bellini, M. F., & Mantovani, M. S. (2009). β-Glucan extracted from the medicinal mushroom Agaricus blazei prevents the genotoxic effects of benzo[a]pyrene in the human hepatoma cell line HepG2. Archives of Toxicology, 83, 81-86. https://doi.org/10.1007/s00204-008-0319-5.
Guo, X., Zou, X., & Sun, M. (2009). Effects of phytohormones on mycelial growth and exopolysaccharide biosynthesis of medicinal mushroom Pellinus linteus. Bioprocess and Biosystems Engineering, 32, 701-707. https://doi.org/10.1007/s00449-009-0326-9
Hosseini S. H., Rafieiolhossaini, M., & Barzegar, R. (2017). Effects of the replacing vermicompost and perlite instead of peat as casing soil ongrowth and yield of mushroom (Agaricus bisporus). Journal of crops improvement (Journal of agriculture), 19(4), 837-852. https://doi.org/10.22059/jci.2018.220952.1583. (In Persi an).
Hussain, N., & Abbasi, S. A. (2018). Efficacy of the vermicomposts of different organic wastes as “clean” fertilizers: State-of-the-art. Sustainability, 10(4), 1205. https://doi.org/10.3390/su10041205.
Jafarpour, M., Poursaeid, N., Jalali Zand, A., Golparvar, A. R., & Behdad, M. (2009). Effect of some of the wastes of agricultural conversion industries and food supplements on some of the specifications of the edible mushroom (Pleurotus florida). Journal of Research in Agricultural Science, 4(2), 188-203.) In Persian).
Kalberer, P. P. (1990). Water relations of the mushroom culture (Agaricus bisporus): Influence on the crop yield and on dry matter content of the fruit bodies. Mushroom Sciences, 13, 269-274. https://doi.org/10.1016/0304-4238(90)90108-Q.
Kalmis, E., & Sargin, S. (2004). Cultivation of two Pleurotus species on wheat straw substrate containing olive mill waste water. International Biodeterioration & Biodegradation, 53, 43-47. https://doi.org/10.1016/j.ibiod.2003.08.002.
Kaveh, M., Pahlavanlu, A., & Sarabi Jamab, M. (2018). Fungies, valuable sources of bioactive β-glucans. Journal of Biosafety, 10(3), 45-65.) In Persian).
Khan, A. L., Waqas, M., Kang, S. M., Al-Harrasi, A., Hussain, J., Al-Rawahi, A., Al-Khiziri, S., Ullah, I., Ali, L., Young Jung, H., & Lee, I. J. (2014). Bacterial endophyte Sphingomonas sp. LK11 produces gibberellins and IAA and promotes tomato plant growth. Journal of Microbiology, 52, 689-695. https://doi.org/10.1007/s12275-014-4002-7.
Khodabakhshi, A., Sedehi, M., & Shakeri, K. (2016). Determination of heavy metals in edible mushrooms consumed in Shahrekord. Journal of Shahrekord University of Medical Sciences, 18(1), 54-62. (In Persian).
Kimasi, A., Dariush, R., Aran, M., Bagheri, R., & Nasiri-Dehsorkhi, A. (2019). Investigating the effects of substrate and nutritional supplements on some vegetative and reproductive characteristics of salmon oyster mushroom (Pleurotus djamor). Iranian Journal of Horticultural Science, 50(3), 571-585. https://doi.org/10.22059/ijhs.2018.254934.1430 .(In Persian).
Kirbag, S., & Akyuz, M. (2009). Evaluation of agricultural wastes for the cultivation of Pleurotus eryngii (DC. ex Fr.) Quel. var. ferulae Lanzi. African Journal of Biotechnolog, 7, 3660-3664. https://doi.org/10.5897/AJB08.583
Lotfi M., Farsi M., Mirshamsi Kakhki A., & Janpoor J. (2018). Influence of pseudomonas putida isolateson the yield of edible white button mushroom agaricusbisporus. Journal of horticulture science (Agricultural sciences and technology, 32(2), 272-286. https://doi.org/10.22067/jhorts4.v32i2.62530. (In Persian).
Makenali, F., Kashi, A. K., & Hekmati, J. (2013). Investigating the effect of culture medium and nutritional supplements on nutritional value of Florida oyster mushroom. Innovation magazine in food science and technology, 6(1), 91-98.) In Persian).
Manayi, A., Vazirian, M., & Saeidnia, S. (2015). Echinacea purpurea: Pharmacology, phytochemistry and analysis methods. Pharmacognosy Reviews, 9(17), 63-72. https://doi.org/10.4103/0973-7847.156353. (In Persian).
Mandeel, Q., Al-Laith, A., & Mohamed, S. A. (2005). Cultivation of oyster mushrooms (Pleurotus spp.) on various lignocellulosic wastes. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 21, 601-607. https://doi.org/10.1007/s11274-004-3494-4.
Marlina, L., Sukotjo, S., & Marsudi, S. (2015). Potential of oil palm empty fruit bunch (EFB) as media for oyster mushroom, Pleurotus ostreatus cultivation. Procedia Chemistry, 16, 427-431. https://doi.org/10.1016/j.proche.2015.12.074.
Masamba, K. G., & Kazombo-Mwale, R. (2010). Determination and comparison of nutrient and mineral contents between cultivated and indigenous edible mushrooms in Central Malawi. African Journal of Food Science and Technology, 4, 176-179.
Mazarei, F., Jooyandeh, H., Hojjati, M., & Noshad, M. (2017). Polysaccharide of caper (Capparis spinose L.) Leaf: Extraction, optimization, antioxidant potential and antimicrobial activity. International Journal of Biological Macromolecules, 95, 231-224. https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2016.11.049. (In Persian).
Miro ´nczuk-Chodakowska, I., & Witkowska, A. (2020). Evaluation of Polish wild mushrooms as beta-Glucan Sources. International Journal of Environmental Research and Public Health, 17, 7299. https://doi.org/10.3390/ijerph17197299.
Mollaie, F., & Besharati, H. (2011). Effect of plant growth promoting bacteria (PGPR) on the qualitative and quantitative properties of button mushroom (Agaricus bisporus) in various substrates of industrial and agricultural waste. Journal of Soil (Soil Science and Water), 25(4), 384-373. https://doi.org/10.22092/ijsr.2012.126519. (In Persian).
Morin, E., Kohler, A., Baker, A. R., Foulongne-Oriol, M., Lombard, V., Nagye, L. G., Ohm, R. A., Atyshakuliyeva, P., Brun, A., & Aerts, A. L. (2012). Genome sequence of the button mushroom Agaricus bisporus reveals mechanisms governing adaptation to a humicrich ecological niche. Proceedings of the National Academy of Sciences, 109, 17501-17506. https://doi.org/10.1073/pnas.1206847109.
Olfati, J. A. & Rasouli, F. (2016). Casing with leached vermicompost improve oyster mushroom biological efficiency. Iran Agricultural Research, 35(1), 95-99.) In Persian).
Park, J. M., Radhakrishnan, R., Kang, S. M., & Lee, I. J. (2015). IAA producing Enterobacter sp. I-3 as a potent bio-herbicide candidate for weed control: a special reference with lettuce growth inhibition. Indian Journal of Microbiology, 55, 207-212. https://doi.org/10.1007/s12088-015-0515-y.
Patil, N. B., Gajbhiye, M., Ahiwale, S. S., Gunjal, A. B., & Kapadnis, B. P. (2011). Optimization of Indole-3-acetic acid (IAA) production by Acetobacter diazotrophicus L1 isolated from Sugarcane. International Journal of Environmental Science, 2, 295-302.
Patill, S. S., Kadam, R. M., Shinde, S. L., & Deshmukh, S. A. (2008). Effect of different substrate on productivity and proximate composition of P. florida. International Journal of Plant Sciences, 3, 151-153. http://dx.doi.org/10.4067/S0718-95162016005000008.
Rajkhowa, D. J., Sarma, A. K., Mahanta, K., Saikia, U. S., & Krishnappa, R. (2017). Effect of vermicompost on greengram productivity and soil health under hilly ecosystem of North East India. Journal of Environmental Biology, 38, 15-19. https://doi.org/10.22438/jeb/38/1/MS-114.
Ratnoo, R., & Doshi, A. (2012). Evaluation of different casing materials and cacing in Agaricus bisporus cultivation. International Journal of Plant Protection, 5, 136-140.
Royse, D. J., Rhodes, T. W., Ohga, S., & Sanchez, J. E. (2004). Yield, mushroom size and time to production of Pleurotus cornucopiae (Oyster mushroom) grown on switch grass substrate spawned and supplemented at various rates. Bioresource Technology, 91(1), 85-91. https://doi.org/10.1016/s0960-8524(03)00151-2.
Rupak, M., Chatterjee, S., Chatterjee, P., & Guha, A. K. (2005). Enhancement of biomass production of edible mushroom Pleurotus sajor-caju grown in whey by plant growth hormones. Process Biochemistry, 40, 1241-1244. https://doi.org/10.1016/j.procbio.2004.05.006.
Ryu, J., Kim, M. K., Im, C. H., & Shin, P. (2009). Development of cultivation media for extending the shelf life and improving yield of king oyster mushrooms (Pleurotus eryngii). Scientia Horticulturae, 193, 121-126. https://doi.org/10.1016/j.scienta.2015.07.005.
Salmones, D., Mata, G., & Waliszewski, K. N. (2005). Comparative culturing of Pleurotus spp. on coffee pulp and wheat straw: biomass production and substrate biodegradation. Bioresource Technology, 96, 537-544. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2004.06.019.
Stajic, M., Persky, L., Hadar, Y., Friesem, D., Duletić-Laušević, S., Wasser, P., & Nevo, E. (2006). Effect of copper and manganese ions on activities of laccase and peroxidases in three Pleurotus species grown on agricultural wastes. Biotechnology and Applied Biochemistry, 128, 87-96. https://doi.org/10.1385/abab.128.1.087.
Taofiq, O., Rodrigues, F., Barros, L., Peralta, R. M., Barreiro, M. F., Isabel, C. F., Ferreira, R., Beatriz, M., & Oliveira, P. P. (2019). Agaricus blazei Murrill from Brazil: an ingredient for nutraceutical and cosmeceutical applications. Food & Function, 10, 565-572. https://doi.org/10.1039/C8FO02461H.
Val, CH., Brant, F., & Miranda, A. S. (2015). Effect of mushroom Agaricus blazei on immune response and development of experimental cerebral malaria. Malaria Journal, 14, 311. https://doi.org/10.1186/s12936-015-0832-y.
Valizade Kaji, B., Abbasifar, A., Ahsani-Irvani, M., & Hossein Abad, M. (2018). Investigating the effect of foliar spraying of vermicompost extract on growth indicators of button mushroom (Agaricus bisporus). Plant Production Technology, 19(1), 36-29. https://sid.ir/paper/405727.) In Persian).
Vieyra, F. E., Palazzi, V. I., Pinto, M. S., & Borsarelli, C. D. (2009). Combined UV-Vis absorbance and fluorescence properties of extracted humic substances-like for characterization of composting evolution of domestic solid wastes. Geoderma, 151, 61-67. https://doi.org/10.1016/j.geoderma.2009.03.006.
Wang, H. T., Yang, L. C., Yu, H. C., Chen, M. L., Wang, H. J., & Lu, T. J. (2018). Characteristics of fucose-containing polysaccharides from submerged fermentation of Agaricus blazei murill. Journal of Food and Drug Analysis, 26, 678-687. https://doi.org/10.1016/j.jfda.2017.07.006.
Wange, Q., Li, B. B., Li, H., & Han, J. R. (2010). Yield, dry matter and polysaccharides content of the mushroom Agaricus blazei produced on asparagus straw substrate. Scientia Horticulturae, 125, 16-18. https://doi.org/10.1016/j.scienta.2010.02.022.
Yadav, A., & Garg, V. K. (2019). Biotransformation of bakery industry sludge into valuable product using vermicomposting. Bioresource Technology, 274, 512-517. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2018.12.023.
Zakaei, M., Bazyar, S., & Khanehbad, M. (2011). Post technology casing soil with use of the vermicompost in mushroom (Agaricus bisporus (L.) Sing) cultivation. Journal of Biology Science, 4(1(12)), 19-26.) In Persian).
Zhang, H., Li, J., Zhang, Y., & Huang, K. (2020). Quality of vermicompost and microbial community diversity affected by the contrasting temperature during vermicomposting of dewatered sludge. International Journal of Environmental Research, Public Health, 17, 1748. https://doi.org/10.3390/ijerph17051748.
Zhang, R., Li, X., & Fadel, J. G. (2002). Oyster mushroom cultivation with rice and wheat straw. Bioresource Technology, 82(3), 277-284. https://doi.org/10.1016/S0960-8524(01)00188-2.